Jahresbericht 1998

Abteilung Neuromorphologie

Wachstum und Regeneration von Nervenfasern werden gesteuert durch sowohl wachstumsfördernde als auch durch wachstumshemmende Moleküle. Vor zehn Jahren ist durch unser Forschungsteam ein Wachstumshemmstoff in den Nervenfaserhüllen (Myelin) des Zentralnervensystems (ZNS) entdeckt und isoliert worden. Inzwischen ist dieser Hemmstoff, "Nogo", biochemisch und molekularbiologisch charakterisiert worden, und es hat sich herausgestellt, daß dieses Protein hauptsächlich durch Oligodendrozyten, die Myelin-produzierenden Zellen des ZNS, synthetisiert wird. Dieses Eiweiß ist ein bis jetzt unbekanntes Eiweiß, das in Ratte, Rind und Mensch zu 80% identisch ist. Verschiedene Antikörper sind entweder gegen das ganze Protein oder gegen einzelne Teile davon produziert worden. Wenn diese Antikörper in vivo bei erwachsenen Ratten eingesetzt werden, führt dies zur Aussprossung und Regeneration von verletzten Nervenfasern. Die Fasern wachsen über größere Distanzen und können ihre ehemaligen Zielgebiete erreichen, gleichzeitig ist auch ein kompensatorisches Wachstum unverletzter Nervenfasern zu beobachten. Diese sogenannte strukturelle Plastizität gleicht einem Vorgang, der sonst nur nach Verletzung in neugeborenen, nicht aber in erwachsenen Ratten und Menschen beobachtet wird. Ob diese Regeneration und Plastizität auch zur funktionellen Erholung führt, wird in umfangreichen Verhaltens- und Lokomotionstests evaluiert. Verschiedene Tests zeigen, daß Ratten, die eine Rückenmark- oder eine Hirnstamm-Verletzung erlitten haben, nach einer Behandlung mit dem Nervenwachstumshemmstoff-neutralisierenden Antikörper mAb IN-1 oder Fab IN-1 neben anatomischen Verbesserungen auch funktionelle Erholung aufzeigen. Je nach Verletzungsort haben sich nach der Antikörperbehandlung Laufbewegungen (Rückenmarksverletzung) oder Feinbewegung der Hand (Hirnstammverletzung) erholt. Diese Resultate zeigen, daß eine Analyse der molekularen und zellbiologischen Mechanismen des Nervenfaser-Wachstums zu Erkenntnissen führen kann, die nicht nur für die neurobiologische und entwicklungsbiologische Grundlagenforschung, sondern auch für zukünftige klinische Anwendungen (Querschnittlähmung, Hirnverletzung) von Bedeutung sind.

Abteilung Neuromorphologie

Leitung: Martin E. Schwab; Wissenschaftliche Koordination: Isabel Klusman; Sekretariat: Silvia Kaufmann

Myelin Proteine, die Nervenfaserwachstum im ZNS hemmen; cDNA Klonierung, Lokalisation und biologische Aktivität.

Maio Chen, Marjan E. van der Haar, Andrea Huber, Thomas Oertle, Eveline Lecoq, Franziska Christ, Tiziana Flego

Die cDNA des aus Rückenmark von Rindern biochemisch gereinigten Hemmstoffes NI-220 wurde kloniert und analysiert. Das korrespondierende Gen wurde Nogo genannt. Nogo kodiert für mindestens 3 Protein Produkte; Nogo-A, Nogo-B, und Nogo-C, wobei Nogo-A das größte Produkt ist. Alle drei Transkripte werden im optischen Nerv, Rückenmark und Cortex in unterschiedlichen Mengen exprimiert. Nogo-C Expression wird vor allem im Skelettmuskel gefunden. Durch in situ Hybridisierung konnte gezeigt werden, daß nicht nur Oligodendrozyten, sondern auch Subpopulationen von Neuronen positiv sind für Nogo. Verschiedene Antikörper wurden gegen Peptidsequenzen oder Teile dieses rekombinanten Hemmstoffes hergestellt. Wie erwartet findet man Nogo Transkripte in Oligodendrozyten, und die Immunozytochemie weist klar eine Zelloberflächen-Lokalisation nach. Die verschiedenen Antikörper werden sowohl molekularbiologisch wie auch zellbiologisch in Bioassays (Neuriten-Wachstum, Fibroblasten Ausbreitung) getestet. Mehrere Antiseren gegen Nogo-A neutralisieren die inhibitorische Aktivität von Myelin und Oligodendrozyten in Ko-Kultur-Experimenten.

Wirkungsmechanismen von Nervenwachstumshemmstoffen

Christine Bandtlow, Jens Fritsche, Barbara Niederöst

Der aus Rinderrückenmark gereinigte Wachstumshemmstoff bNI-220 zeigt seine Wirkungsweise (Kollaps und Retraktion von Nervenfasern) schon in sehr geringen Konzentrationen, was auf das Vorhandensein spezifischer Bindungsmoleküle/Rezeptoren auf den Nervenzellen hinweist. Bislang konnte allerdings die molekulare Identität derartiger Bindungsmoleküle nicht entschlüsselt werden. Allerdings haben wir weitere Einblicke in die intrazellulären Signalwege von bNI-220 insbesondere in Wachstumskegeln von Nervenfasern gewonnen. Es zeigte sich, daß speziell eine Familie von GTPasen (rho-GTPasen) eine essentielle Rolle als Übermittler spielen. Wird die endogene Aktivität eines bestimmten Mitglieds (rhoA) dieser rho-GTPasen mittels eines bakteriellen Enzyms ausgeschaltet, ändert sich auch die Antwort der Nervenfasern auf die Wirkung von bNI-220. Durch hochauflösende konfokale Mikroskopie konnten wir kürzlich zeigen, daß die Inaktivierung von rhoA zu einer Veränderung bestimmter Zytoskelett-Komponenten (Aktin Mikrofilamente; dynamische und stabile Mikrotubuli) im Wachstumskegel führt. Vergleiche mit anderen Wachstumshemmstoffen (Semaphorin III und Thrombin) zeigten, daß gerade diese Reaktionen des Zytoskeletts sehr unterschiedlich sein können und vermutlich durch differentielle Signalwege der einzelnen Faktoren herbeigeführt werden.

Biologische Funktionen von Nervenwachstummshemmstoffen in embryonalen und jungen Tieren

Christian Brösamle, Andrea Huber

Mit der kürzlich erfolgten Aufklärung der Genstruktur des Nervenwachstumshemmstoffs Nogo bietet sich eine Möglichkeit, mittels molekularer Techniken die funktionellen Rollen zu untersuchen, die der Wachstummshemmstoff im Nervensystem hat. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen könnten zu einem besseren Verständnis von möglichen Nebenwirkungen der Neutralisation dieses Hemmstoffs führen. Das Gen des Hemmstoffes wird in 3 verschiedenen Formen in unterschiedlichen Teilen des ZNS sowohl während der Embryonalentwicklung als auch nach der Geburt exprimiert. Dieses Expressionsmuster deutet nebst Nervenfaserwachstumshemmung auf zusätzliche Funktionen hin. Durch Gentransfer eines adenoviralen Vektors sollen die verschiedenen Formen von Nogo in unterschiedlichen Entwicklungsstadien an bestimmten Orten des ZNS von Ratten zur Expression gebracht werden. In der Folge wird die Reaktion von bestimmten, gut bekannten Nervenfasersystemen auf die Expression untersucht (Faserwachstum, Verzweigung, Wegleitung, Regeneration usw.).

Regeneration verletzter Faserbahnen im Hirnstamm und Rückenmark erwachsener Ratten

Christian Brösamle, Lisa Schnell, Olivier Raineteau, Oliver Weinmann

Nach einer Rückenmarksverletzung erfolgt in nicht behandelten Tieren auf eine anfängliche spontane Sprossung neuer Seitenzweige eine Retraktion dieser Zweige. In Antikörper-behandelten Tieren, sowohl nach mAb IN-1 wie nach Behandlung mit einem gentechnologisch hergestellten, teilhumanisierten Fab Fragment von mAb IN-1, wachsen die Corticospinaltrakt (CST) Fasern jedoch auf Gewebebrücken um die Verletzungsstelle herum und in den unteren Teil des Rückenmarks ein. Die regenerierten Fasern verzweigen sich in der grauen Substanz des Rückenmarks. In einem Pilot-Experiment sind erwachsene Ratten nach einer Verletzung einem Antiserum gegen Nogo-A behandelt worden: Zwei Wochen später wuchsen ebenfalls regenerierende Fasern um die Verletzungsstelle ins untere Rückenmark ein. Nach einer einseitigen Verletzung der Corticospinalbahn im Hirnstamm erwachsener Ratten und Behandlung mit dem monoklonalen Antikörper IN-1 zeigen verletzte Fasern Regeneration im ganzen Hirnstammbereich und im zervikalen Bereich des Rückenmarks. Die funktionelle Rolle dieser regenerierenden Fasern wird anhand verschiedener Verhaltenstests geprüft. Über die regenerative Kapazität des Rubrospinaltrakts ist bislang nicht viel bekannt. Neue Studien untersuchen diese Kapazität nach einer Rückenmark-Verletzung und anschließenden Behandlung mit neutralisierendem Antikörper.

Strukturelle Plastizität nach einer Verletzung im Gehirn oder Rückenmark

Michaela Thallmair, Olivier Raineteau, Christian Wenk, Antonio Iania

Eine Verletzung von Gehirn oder Rückenmark früh im Leben bewirkt ein kompensatorisches Wachstum verbleibender Systeme, das zu neuen Verbindungen führt und oft eine große funktionelle Erholung bewirkt. Nach einer ZNS Verletzung im erwachsenen Tier jedoch ist die funktionelle und anatomische Erholung äußerst gering. Diese Abnahme des Nervenfaserwachstums korreliert stark mit der Myelinisierung des Nervensystems. Die Rolle des Myelin-assoziierten Wachtumshemmstoffs in der Beschränkung von Plastizität wurde untersucht durch einseitige Durchtrennung des Corticospinaltrakts oder nach einer einseitigen Verletzung des motorischen Cortex und einer anschließenden Behandlung mit dem Hemmstoff-neutralisierenden Antikörper IN-1. Dabei zeigte die unverletzte Corticospinalbahn ein Aussprossen von neuen Faserverbindungen im Hirnstamm (Nucleus Ruber und Pons) und im Rückenmark. Diese anatomisch erhöhte Plastizität führt vermutlich zu neuen Verschaltungen, die sich auch funktionell auswirken: feine Bewegungen der Vorderpfoten ("Präzisionsgriff") waren in den Antikörper-behandelten Tieren gleich gut möglich wie in normalen Ratten, sehr im Gegensatz zu den stark behinderten verletzten Kontrolltieren.

Inflammatorische Reaktion nach einer Rückenmarks- oder Hirnverletzung

Lisa Schnell, Isabel Klusman, Eveline Frei, Regula Schneider

Bereits wenige Stunden nach einer Rückenmarksverletzung zeigt sich am Verletzungsort ein Gebiet mit sekundärem Zelltod und starker Entzündung. Es ist nun nicht klar, ob diese Entzündung zu einer zusätzlichen Schädigung des Gewebes führt, oder ob ihre Folgen den Heilungs- und Vernarbungsprozess oder das Überleben des umgebenden Gewebes günstig beeinflussen. Unter Zugabe von pro-inflammatorischen (IL-1, IL-6, TNF) oder anti-inflammatorischen (IL-4, IL-10, IL-13) Zytokinen konnte vier Tage nach einer Rückenmarksverletzung bei männlichen Mäusen eine Verkleinerung des Verletzungsbereichs gezeigt werden. Eine ähnliche Behandlung bei weiblichen Mäusen zeigt keine Veränderung des Verletzungsbereichs. Geschlechtsspezifische Unterschiede könnten eine Rolle spielen, da bekannt ist, daß Progesterone nach einer Hirnverletzung einen positiven Einfluß auf die Oedem-Entwicklung hat. Quetschläsionen des Rückenmarks von erwachsenen Ratten, die etwa die Hälfte der Nervenbahnen betreffen, den Ratten aber noch Restbewegungen der Hinterbeine und eine gute Kontrolle von Darm und Blase ermöglichen, stellen ein gutes Modell der menschlichen Rückenmarksverletzungen dar. Bei diesen Tieren wurde untersucht, ob die Entzündungsreaktion verantwortlich sein kann für die Schäden an der isolierenden Myelinscheide, die schon kurze Zeit nach der Verletzung sichtbar werden. Obwohl Entzündungszellen, Makrophagen und aktivierte Mikroglia vorhanden sind an Orten, wo Axone noch intakt sind, wurde hier kein Verlust von Oligodendrozyten beobachtet. Völlige Ausschaltung der neutrophilen Granulozyten und/oder der Makrophagen hatte ebenfalls keinen sichtbaren Einfluß auf die Größe des Gewebeverlustes. Die physiologische Rolle der Entzündung an diesen Verletzungsstellen bleibt also noch zu definieren.

Verbesserte Erholung der Lokomotion in rückenmarksverletzten und Antikörper-behandelten Ratten

Karim Fouad, Gerlinde Metz, Doron Merkler, Jeannette Scholl

Nach einer inkompletten Rückenmarksverletzung und anschließender Behandlung mit IN-1 Antikörpern sind die Tiere in einer Reihe von Lokomotions-Tests ("open field" BBB-score, kinematische Analyse, Laufen über ein unregelmäßiges Gitter, Klettern am Seil) getestet worden. Anhand dieser Tests wurde die lokomotorische Kapazität und die Bewegungskontrolle während der Rehabilitationsphase dokumentiert. In allen Tests zeigten die IN-1 behandelten Tiere eine verbesserte Erholung im Vergleich zu einer nicht behandelten Gruppe. Signifikante Fortschritte waren vor allem deutlich beim Laufen über ein unregelmäßiges Gitter. Um Veränderungen im Schmerzempfinden nach IN-1 Behandlung festzustellen, wurde auch die Empfindlichkeit auf Kälte oder Berührung gemessen. Zwischen den behandelten und nicht behandelten Gruppen wurden keine Unterschiede beobachtet, was darauf hinweist, dasß die IN-1 Behandlung keinen Einfluß auf das Schmerzempfinden hat. Anatomisch könnten, in den Antikörper-behandelten Tieren, sowohl regenerierte Fasern wie kompensatorisches Wachstum für die verbesserte und schnelle Erholung verantwortlich sein.

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Christian Broesamle